腸道病毒EV71核酸檢測試劑盒使用及效果：

將壓碎的一小片重量約在100mg左右的植物種子（約1/4黃豆大小）或直徑約為0.5-0.7cm（或面積相當(dāng)?shù)钠渌螤睿┑闹参锶~片直接加到新鮮配制的0.1mL溶液A中，95℃保溫10-15分鐘，加入0.1mL溶液B，混勻，直接取上清液（相當(dāng)于PCR體積的1/10）作為模板進行PCR。剩余樣品可以放4℃保存。

樣本采集、存放及運輸：

1、樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

2、存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（最多凍融3次）；

3、運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。

普通PCR反應(yīng)流程：

自備物品：

15毫升錐形離心管：用于制備樣品的容器

比色皿：用于比色的容器

96孔酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

酶標(biāo)儀：用于微量樣品比色分析

儲存條件：14℃或－20℃

準(zhǔn)備物品

清理液（A）毫升

染色液（t B）微升

稀釋液（C）毫升

溶解液（tD）毫升

產(chǎn)品說明書1份

反應(yīng)五要素：

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：

引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。