ADPG焦磷酸化酶(AGP)測(cè)試盒微量法

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商品屬性：

測(cè)定意義：

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與 ATP 反應(yīng)生成淀粉合成的直接 前體 ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。

測(cè)定原理

AGP 催化的逆向反應(yīng)生成 G1P，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫 酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm 下測(cè)定 NADPH 增加速率，即可計(jì)算 AGP 活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存;

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 9mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 4mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

粗酶液制備 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

訂購(gòu)流程:

1、訂購(gòu)前,請(qǐng)與銷(xiāo)售員核對(duì)產(chǎn)品中文名稱(chēng)/CAS號(hào)/英文名稱(chēng)等。

2、我司大部分產(chǎn)品都是現(xiàn)貨,產(chǎn)品核實(shí)好下單后即可當(dāng)天發(fā)貨。(庫(kù)存信息以當(dāng)日為準(zhǔn))如有特殊要求請(qǐng)?jiān)诎l(fā)貨前與銷(xiāo)售員聯(lián)系。

3、我司產(chǎn)品支持款到發(fā)貨、快遞代收尾款、網(wǎng)上現(xiàn)拍等付款方式。

4、質(zhì)量保證,嚴(yán)格把關(guān),如有產(chǎn)品異議經(jīng)公司鑒定確認(rèn)后可包換包退,免除客戶(hù)后顧之憂(yōu)。

5、我司提供完善的售后服務(wù),使用過(guò)程中如有任何疑問(wèn),可提供技術(shù)指導(dǎo)。

測(cè)定步驟:

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一置 30℃保溫 10min 以上。

3、在 EP 管中按順序加入下列試劑

試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管

試劑一 50

試劑二 80

樣本 10

混勻，30℃保溫 15 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴迅速冷卻后，4000g4℃

離心 5min，取上清液，在 96 孔板中依次加入下列試劑

上清液 80

試劑一 85

試劑三 35

混勻后，立即于 340 nm 波長(zhǎng)下記錄初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

AGP 活性計(jì)算

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、按樣本蛋白蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活性單位。

AGP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109

]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)=2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

AGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109

]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T×稀釋倍數(shù)=2813×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4

L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L / mol /cm；d：

比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：

反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.75；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。

b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、按樣本蛋白蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活性單位。

AGP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109

]÷(V 樣×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)=5627×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

AGP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109

]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T×稀釋倍數(shù)=5627×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4

L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L / mol /cm；d：

96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：

反應(yīng)時(shí)間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.75；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量。

生化試劑盒的使用注意事項(xiàng)：

選擇合適的試劑盒：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜋z測(cè)對(duì)象選擇合適的試劑盒，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。

嚴(yán)格遵循說(shuō)明書(shū)：按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，避免誤用或浪費(fèi)。

注意保存條件：按照試劑盒的保存條件進(jìn)行妥善保存，避免陽(yáng)光直射、高溫或潮濕等不利因素。

控制實(shí)驗(yàn)條件：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，如溫度、時(shí)間、pH值等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

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