NAD蘋果酸酶(NADME)測(cè)試盒微量法

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商品屬性：

測(cè)定意義：

ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和CO2，以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來(lái)植物ME活性測(cè)定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一性和對(duì)底物特異性的不同，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
測(cè)定原理：
NAD-ME催化NAD+還原成NADH，在340nm下測(cè)定NADH增加速率。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存。；

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，

加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

訂購(gòu)流程:

1、訂購(gòu)前,請(qǐng)與銷售員核對(duì)產(chǎn)品中文名稱/CAS號(hào)/英文名稱等。

2、我司大部分產(chǎn)品都是現(xiàn)貨,產(chǎn)品核實(shí)好下單后即可當(dāng)天發(fā)貨。(庫(kù)存信息以當(dāng)日為準(zhǔn))如有特殊要求請(qǐng)?jiān)诎l(fā)貨前與銷售員聯(lián)系。

3、我司產(chǎn)品支持款到發(fā)貨、快遞代收尾款、網(wǎng)上現(xiàn)拍等付款方式。

4、質(zhì)量保證,嚴(yán)格把關(guān),如有產(chǎn)品異議經(jīng)公司鑒定確認(rèn)后可包換包退,免除客戶后顧之憂。

5、我司提供完善的售后服務(wù),使用過(guò)程中如有任何疑問(wèn),可提供技術(shù)指導(dǎo)。

測(cè)定步驟:

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 檢測(cè)工作液的配制：用時(shí)在試劑三中加入 15mL 試劑一和 1mL 蒸餾水，充分混勻待用；

用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、 測(cè)定前將檢測(cè)工作液在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、55μL 試劑二和 160μL 工作液，混勻

后立即記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

注意：如果 ΔA＜0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到 2 分鐘或 5 分鐘。

NAD-ME 活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =3617×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T =7.234×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：

比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：

反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T = 7234×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣÷V 樣總×500) ÷T =14.468×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol；d：96孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：

反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

生化試劑盒的使用注意事項(xiàng)：

選擇合適的試劑盒：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜋z測(cè)對(duì)象選擇合適的試劑盒，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。

嚴(yán)格遵循說(shuō)明書：按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，避免誤用或浪費(fèi)。

注意保存條件：按照試劑盒的保存條件進(jìn)行妥善保存，避免陽(yáng)光直射、高溫或潮濕等不利因素。

控制實(shí)驗(yàn)條件：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，如溫度、時(shí)間、pH值等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

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